HPLC lahutuse optimeerimine

Sissejuhatus

Pöördfaaskromatograafias toimub ainete lahutumine polaarsuse alusel. Mittepolaarsed ühendid interakteeruvad statsionaarse faasiga tugevamalt ja seetõttu on nende liikumine kolonnis pidurdatud. Polaarsed ühendid seevastu läbivad kolonni suhteliselt kiiresti.

Vedelikkromatograafias mõjutavad ainete retentsiooni järgmised tegurid:

Kõige levinumaks statsionaarseks faasiks pöördfaaskromatograafias on kujunenud oktadetsüül-modifitseeritud silikageel. Sellise täidisega kolonni kasutatakse ka käesolevas töös.

Mobiilne faas koosneb tugevast ja nõrgast komponendist. Tugevaks nimetatakse eluendi komponenti, mis põhjustab analüüdi retentsiooniaja lühenemist. Pöördfaaskromatograafias on tugev komponent orgaaniline ja nõrk - vesi. Mobiilse faasi elueerivat jõudu reguleeritakse tugeva ja nõrga komponendi segamisega erinevates vahekordades.

Kui uuritav aine on aluseliste või happeliste omadustega, siis olenevalt keskkonna pH-st võib see aine esineda neutraalses või ioniseeritud vormis. Kuna neutraalses vormis osake on väiksema polaarsusega, siis on ka selle retentsiooniaeg pikem. Seega on ka mobiilse faasi pH-l oluline roll kromatograafilise lahutuse optimeerimisel.

Temperatuuri mõju on reegline küllaltki väike, kuid raskete proovide puhul saab seda efekti siiski ära kasutada. Kõrgemal temperatuuril on efektiivsus (N) reeglina suurem. Kui temperatuur mõjutab molekuli struktuuri või ionisatsioonitasakaalu, siis võib temperatuuri mõju olla märkimisväärne.

Eluendi pH mõju aluseliste või happeliste analüütide retentsioonile

Vaatleme happelist analüüti dissotsiatsioonikonstandiga pKa. Kui eluendi pH on oluliselt madalam analüüdi pKa-st, siis on happe molekul protoneeritud ja tema retentsioon on maksimaalne. Kromatograafilise piigi kuju on korralik (miks?). Eluendi kõrgema pH juures (pH > pKa) on oodata analüüdi minimaalset retentsiooni ja asümmeetrilist piigi kuju. Vahepealsete pH väärtuste juures (pH = pKa ± 2) on retentsiooniajad keskmised ja piik madal ning laialivalguv.

Aluseliste analüütide korral on olukord analoogiline. Kui eluendi pH > pKa, siis on retentsiooniaeg maksimaalne ja piik sümmeetriline. Madala pH korral on retentsiooniaeg lühike ja piik ebasümmeetrilise kujuga. Vahepealsete pH väärtuste juures (pH = pKa ± 2) on retentsiooniajad jällegi keskmised ja piik madal ning laialivalguv. Retentsiooniaja sõltuvust eluendi pH-st kirjeldab ligilähedaselt joonis 1.

Aluselise analüüdi retentsiooniaja sõltuvus eluendi pH-st.

Joonis 1. Aluselise analüüdi retentsiooniaja sõltuvus eluendi pH-st.

Praktiline osa

Käesolevas töös valmistatakse rida puhverlahuseid laias pH-de vahemikus, vastavalt kirjanduses [1] toodud eeskirjadele. Eluent valmistatakse puhverlahuse ja orgaanilise solvendi (modifikaatori) segamisel etteantud vahekorras.

Registreeritakse etteantud analüütide kromatogrammid UV-Vis detektoriga HPLC süsteemil (abiks on [2-3]). Trükitakse välja esinduslikud kromatogrammid, arvutatakse lahutust iseloomustavad parameetrid ja tuuakse välja üldised tendentsid erineva pH-ga eluentide kasutamisel.

Kuidas alustada?

  1. Koosta nimekiri küsimustest, millele peab enne töö praktilist alustamist vastama. Saada see nimekiri juhendajale (koit.herodes[at]ut.ee) vähemalt 1 tööpäev enne töö praktilise osa algust!
  2. Milliseid piiranguid eluendi pH-le seab pöördfaaskolonn?
  3. Millise kontsentratsiooniga puhverlahus valmistada?
  4. Kuidas analüütide piike ära tunda?
  5. jne.

Vastused saad kirjandusest (ja juhendajalt). Koosta endale tööjuhend, kus oleks ära toodud vajalikud ained (kogused!), materjalid ja seadmed.

Vajalik kirjandus

  1. Practical HPLC method development - 2nd ed., LR Snyder, JJ Kirkland, JL Glajch, Wiley 1997.
  2. Analüütilise keemia praktikum 2 materjalidest toidukonservantide määramise töö juhend: http://tera.chem.ut.ee/~ivo/praks/hplc/hplc.doc
  3. Jasco UV-Vis detektori kasutusjuhend